一抗孵育時間,不能超過多久
回答:一抗的孵育時間與温度、抗體濃度有關。一般情況下,在37℃的條件下,孵育1-2小時左右。在室温的條件下,孵育3小時左右。在4℃的條件下,孵育18-24小時左右。如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長,會導致非特異性吸附,增加洗滌的難度,最終因洗滌不徹底而出現非特性顯色。
一、一抗孵育時間,不能超過多久
1、一抗的定義
一抗指的是能夠和非抗體性抗原(特異性抗原)特異性結合的蛋白,也就是平常所説的抗體。二抗指的是能和抗體結合的抗體,主要用於檢測抗體的存在,放大一抗的信號。
2、一抗的孵育時間
(1)一抗的孵育時間與温度,抗體濃度有關。一般情況下,在37℃的條件下,孵育1-2小時左右。在室温的條件下,孵育3小時左右。在4℃的條件下,孵育18-24小時左右。
(2)如果一抗的濃度過高或者是孵育時間過長,會導致非特異性吸附,增加洗滌的難度,最終因洗滌不徹底而出現非特性顯色。
二、雙抗體夾心法檢測未知抗原
1、包被
用0.05M碳酸鹽包被緩衝液(ph9.6)對抗體進行稀釋,直至蛋白質含量為1-10μg/ml為止。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。第二天的時候,去掉孔內溶液,然後用洗滌緩衝液洗3次,每次3分鐘。
2、加樣
將0.1ml經過稀釋的待檢樣品放到反應孔中,在37℃的環境條件下孵育1小時,然後進行洗滌。
3、加酶標抗體
在各個反應孔中,加入0.1ml新鮮稀釋的酶標抗體,在37℃的環境條件下,孵育0.5-1小時,然後進行洗滌。
4、加底物液顯色
在各個反應孔中,加入0.1mlTMB底物溶液(應當臨時配製),37℃的環境條件下10-30分鐘。
5、終止反應
在各個反應孔孔中,加入0.05ml的2M硫酸。
6、結果測試
(1)在白色背景下,用肉眼進行觀察即可。反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺。
(2)在ELISA檢測儀上,於450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零後測各孔O·D值,如果大於規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
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